本发明公开了一种基因定向克隆用TC载体及其制备和使用方法，该载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。其制备方法包括：a.填充序列的引物设计，由此得到引物1和引物2；b.在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；c.将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体；d.内切酶酶切该前TC载体并回收载体片段就可得到TC载体。其使用方法包括：a.制备TC载体；b.设计一对待定向克隆基因的PCR引物；c.用这对引物和Taq酶扩增待定向克隆基因并将产物连接于TC载体即可获得定向克隆重组载体。本发明提高了从通用目的载体出发进行的重组载体的构建的工作效率，可减低实验成本。
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